（1）什么是流式细胞术？

流式细胞术（Flow cytometry，FCM）是将制备好的单细胞悬液，在悬液中的细胞以很的流速通过光照区，其产生的光学或电子信号被敏感的探测器接受，并测得细胞会亚细胞成分的重要生物学性质（如细胞的体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征），这些被测得的生物学性状及功能状态被定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。

目前，该技术已经广泛用于基础研究与临床检验，在免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、移植医学和细胞凋亡等领域内发挥着重要作用。

（2）流式细胞术的基本原理是什么？

流式细胞仪主要包括以下几个组成部分：激光系统、流动系统、信号处理及放大的系统、计算机系统。当待测标本被制成单细胞悬液，经染色后进入流动室，流动室充满流动的鞘液，鞘液压力与样品流压力是不同的，当两者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着的样品流中的细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料，这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发产生特定波长的荧光，通过一系列信号转换、放大、数字化处理，就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征，如果对具有某种特征的细胞有兴趣，还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。

（3）流式细胞术有哪些特点？

流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术，与其他细胞分析技术相比有以下特点：

1）高速度，每秒钟可以检测1000~5000个细胞。

2）高灵敏度，每个细胞只要带有1000~3000个荧光分子就能检出,两个细胞之间有5%的差别就可区别出来,光散射的灵敏度为0.3μm。

3）高精度,在细胞悬液中测量细胞,比其它分析技术的变异系数更小,分辨率高。

4）高纯度，分选细胞的纯度可达99%以上。

5）多参数，从一个细胞中同时可定量检测DNA、RNA等多个参量。

6）在适当的条件下，可对活细胞进行无害性的分析和分选。

（4）流式细胞术可测量的参数有哪些？

主要参数可范围结构和功能两部分。

结构：a. 细胞的大小、形态 b. 细胞和与细胞浆比值c. 色素颗粒 d. 亚细胞形态e. DNA、RNA、蛋白质含量 f. 细胞表面抗原g. 碱性蛋白 h. 染色体结构i. 细胞表面糖原等

功能：a. 氧化还原酶状态 b. 表面电荷 c. pH值 d. 膜电位e. 酶活性 f. DNA合成能力 g. 膜的流动性 h. 细胞内受体i. 线粒体膜电位 k. 细胞浆和膜的钙离子活性l. 细胞膜受体等

（5）影响流式细胞术定量分析的因素

主要是各个环节的稳定性：

1）细胞的荧光染色 细胞荧光染色相对一致是其重要因素之一。在同类细胞样品中，要保证每个细胞对荧光染料分子的亲和力相对一致，做到人色的浓度、时间、温度、pH值、细胞数相对一致。还要避免细胞的染色发生饱和效应，因而染液的浓度要合适。

2）激光光源的稳定性 不仅要求激发光束的功率高、稳定性好，还要求广场分布一致。故激光的工作状态应该呈TEMoo模式，光场为单一的高斯分布。

3）细胞流速的稳定性 要保证通过光学检测区的每个细胞流速相等。

4）细胞悬液样品的影响 细胞粘连、团块常造成管道阻塞，重叠细胞可造成分析误差，也可引起分选失败，造成分选脉冲的自动消失。杂质碎片过多，噪音大于信号，也可造成分析失败。

（6）流式细胞术单细胞悬液的基本制备方法有哪些？

目前主要有三种基本的方法：

1）酶学法 酶可以通过①破坏组之间的胶原纤维、弹性纤维等；②水解组织间的粘多糖；③水解组织细胞间紧密连接装置的蛋白质，使得组织分散成单细胞。但在使用过程中需要注意是①溶解酶的溶剂；②酶所处的环境（pH值）；③酶的浓度等，如果与酶的需要不相符，均可以影响其分散效果。

2）化学法 螯合剂y与Ca2+、镁、单价阳离子结合后，可以使这些阳离子从组织中替代出来而是细胞分散下来。螯合剂主要有：EDTA（乙二醇-N.N-四乙酸钠盐）、TPB（斯基苯硼）和柠檬酸钠。

3）物理法 物理法包括筛网搓、剪碎、超声振荡等。对于来自于幼稚的胚胎组织、淋巴组织和造血组织以及具有松散排列的组织器官的组织，使用此方法可以获得较好的分散效果。但对于紧密连接的组织，适用本法就会损伤细胞，甚至出现细胞团块。制成的单细胞悬液的密度大约是1106~107 /ml。

（7）单细胞悬液有哪些保存方法？

在不能马上上机检测或样品的数量不够的情况下，为了防止细胞自溶，应将单细胞悬液先保存起来，待时机成熟时再进行检测。其保存方法主要有：

1）深低温保存 先把单细胞悬液放入盛有3ml保存液的塑料管中，封好盖，然后再把塑料管浸入盛有99%乙醇和干冰混合的器皿中，置-80℃冰箱保存。测定时，湘江保存的样品从冰箱中取出，使其在37℃的恒温水浴中速溶，以1500prm的转速离心5min ，其上清，然后再用生理盐水反复冲洗2～3次，即可染色上机测定。此方法可保存1年，是一种比较理想的保存方法。

2）70%乙醇或75%甲醇固定保存 将单细胞悬液锤打分散，迅速放入乙醇或甲醇中（边放边振荡），置4℃冰箱保存即可。但固定时间一般只有维持1～2周。3）其他 戊二醛、甲醛都是理想的细胞固定剂，不但可以防止细菌的生长，并可保持细胞形态结构和生物化学成分不发生改变。但该类固定剂对插入性荧光染料与核算结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜样品荧光强度的50～70%，而且被固定后的细胞常常产生较强的非特异性荧光，故最好不用醛类固定剂固定细胞。