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受体定位技术
作者:  来源:  发布时间:2018年12月23日 08:34  浏览次数:

神经递质和神经活性物质担负着在神经元之间传递信息的任务。在它们所作用的细胞上(内)存在着特异性的和某些神经递质或神经活性物质结合而使其发挥调节效应的物质,叫做受体。受体能够认识具有特定构造的化学物质并与之特异性的结合,神经递质或神经活性物质合受体结合的复合体可以产生生物学效应。一般来说,受体是蛋白质。配体是指能与受体借助亲和力结合的物质的总称。配体包括有关的神经递质、神经活性物质和常用的受体拮抗剂及其激动剂。研究受体在神经系统内的定位和分布,主要有三类方法:配体标记法、免疫组织化学法和原位杂交法。

(1)配体标记法

1979年,Young和Kuhar创建了用放射性核素放射自显影技术检测受体的方法后,对受体的种类、分布和定位的研究起到了积极的推动作用。配体标记法主要在组织切片上进行,利用标记的配体和受体结合以显示受体的存在部位。由于配体和受体的结合是可逆的,在水性环境下可以从受体上脱落。这个现象决定了配体法技术上的一些特点。首先是标记配体的选择,应尽可能选择高亲和力及特异性强的拮抗剂或激动剂。配体通常用放射性核素标记。其次,应尽量减少切片与水的接触。

配体标记法的基本步骤如下:将组织用恒冷箱切片机切成冷冻切片,铺贴于载波片上。洗去切片上的内源性配体,以免与标记配体竞争性的结合受体。用标记的配体孵育切片,洗去多余配体及一些非特异结合的配体,尽快使切片干燥。放射自显影过程中不用湿乳胶,而用感光底片或用干乳胶法,即将核子乳胶涂抹于盖波片上,待干燥后再盖压在切片上。待放射性核素使感光底片或涂抹的核子乳胶感光后,经过显影、定影就可以在感光底片或核子乳胶上观察结果。

(2)免疫组织化学染色法

受体的免疫组织化学染色显示方法有两种。第一种方法是制备针对受体的抗体。其前提是要有提纯的受体或已知受体蛋白的氨基酸序列,可以用人工合成受体的多肽片段,来制备抗体。得到不同受体及其亚型的特异性抗体之后,只要用前述的免疫细胞(组织)化学或免疫荧光组织化学染色方法,即可准确显示和定位受体及其亚型所在的部位。第二种方法是利用受体的抗独特型受体。独特型指在抗体分子可变区中抗原结合位点内及其邻近的一些抗原决定簇。用某种抗体做抗原来免疫动物后,由该抗体所产生的针对这些独特型决定簇的抗体为抗独特型抗体。这种方法的特异性和敏感性均不如人工合成受体的多肽片段作为抗原制备针对受体的特异性抗体的方法,现在已经几乎弃置不用。

(3)原位杂交组织化学法

原位杂交组织化学法是通过应用已知的受体基因的碱基序列,合成与之互补的并带有标记物的探针与切片上神经元中待测的mRNA进行特异性结合,形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,在核酸的原有位置对受体的mRNA进行定位的方法。这一技术对研究神经元内编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段,为从分子水平研究神经元内基因表达及其调控提供了有效的工具。

 
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