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酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)
作者:  来源:  发布时间:2018年12月23日 08:34  浏览次数:

(1)何谓ELISA?

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是一种特殊的试剂分析方法,是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型免疫测定技术 。1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,自此以后,发展十分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(2)ELISA的基本原理?

EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性,抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例,加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可以大大地放大其反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。ELISA不仅可用于测定抗原,也可用于测定抗体。

(3)ELISA测定必用的试剂有几种?

有三种:1)固相的抗原或抗体(免疫吸附剂);2)酶标记的抗原或抗体(标记物);3)酶作用的底物(显色剂)。

(4)常见的ELISA检测方法有几种?

常见的检测方法有五种。 根据试剂的来源和样品的性状以及检测的具体条件,可分为:①双抗体夹心法,主要用于检测抗原;②间接法,主要用于检测抗体;③竞争法,既可用于检测抗原又可用于检测抗体;④双抗原夹心法,用已知抗原检测未知抗体;⑤中和法,检测抗体。但最常用的是双抗体夹心法及间接法。

(5)ELISA标本应如何保存?

可用作ELISA测定的标本十分广泛,如体液(血清)、分泌物(唾液)和排泄物(尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经过预处理(如粪便和某些分泌物)后再进行测定。大部分ELISA的检测以血清为标本。而血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。制备血浆标本需使用抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得,故除特殊情况外,在医学检验中均以血清作为检测标本(虽然在ELISA检测中血浆和血清可同等应用)。

血清标本可按常规方法采集,但应注意避免溶血,因为红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,在以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。另外在采集血清时还应注意无菌操作,如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。因而也可在血清中加入适当的防腐剂。

血清标本宜在新鲜时检测。如在冰箱中保存过久,在间接法ELISA测定中本底的颜色可以加深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃保存,若超过一周测定时需低温冰存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀(混匀时动作要轻,可上下颠倒混和,应避免气泡的产生,不要在混匀器上强烈振荡)。混浊或沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融可使抗体的效价跌落,所以需要测抗体的血清标本如果要作多次检测的话,宜少量分装冻存。

(6)ELISA常用方法的操作步骤

因为ELISA最常用的方法是双抗体夹心法及间接法,其操作步骤是:

(一)用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1)包被:用0.05M pH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3min。(简称洗涤,下同)。2)加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1h。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。3)加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1h,洗涤。4)加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30min。5)终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6)结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

(二)用于检测未知抗体的间接法:

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,

每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔

中,置37℃孵育1h,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,

37℃孵育30-60min ,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

(7)ELISA测定时常用的试剂和器材有哪些?

(1)试剂

① 包被缓冲液(pH9.6,0.05M碳酸盐缓冲液):

Na2CO3 1.59g

NaHCO3 2.93g

加蒸馏水至1000ml

② 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS):0.15M

KH2PO4 0.2g

Na2HPO4•12H2O 2.9g

NaCl 8.0g

KCl 0.2g

Tween-20 0.05% 0.5ml

加蒸馏水至1000ml

③ 稀释液:

牛血清白蛋白(BSA) 0.1g

加洗涤缓冲液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5~10%使用。

④ 终止液(2M H2SO4):

 蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。

⑤ 底物缓冲液(pH5.0磷酸棗柠檬酸):

0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml

0.1M 柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml

加蒸馏水50ml。

⑥ TMB(四甲基联苯胺)使用液:

TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml

底物缓冲液(pH5.5) 10.0ml

0.75%H2O2 32.0μl

⑦ ABTS使用液:

ABTS 0.5mg

底物缓冲液(pH5.5) 1.0ml

3%H2O2 2.0μl

⑧ 抗原、抗体和酶标记抗体。

⑨ 正常人血清和阳性对照血清。

(2)器材:

① 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔,ELISA检测仪,50μl及100μl加样器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶。

② 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

③ 4℃冰箱,37℃孵育箱。

8. ELISA操作时应注意哪些要点?

(1) 试剂的准备

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水(包括洗涤用的),应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试剂应待温度与室温平衡后再使用。若试剂盒中本次实验不需要使用的部分应及时放回冰箱保存。

(2) 加样

在ELISA测定过程中一般有3次加样品的步聚,即加标本,加酶结合物和加底物。加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中,注意一定要将样品加在LEISA板孔的底部,不要产生气泡。每次加标本时应更换吸头,以免发生交叉污染。测定(如间接法ELISA)时若需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样;也可以在板孔中先加入稀释液,然后再加入血清标本,并在微型震荡器上震荡1min 以保证充分混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器,以使加液过程迅速完成。

(3) 保温

在ELISA测定中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物。抗原抗体反应的完成需要一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation)。

ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2h,产物的生成可达顶峰。为加速反应,可提高反应的温度,有些试验在43℃进行,但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,以形成最多的沉淀。但因所需时间太长,在ELISA中一般不予采用。

保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外,一般均采用水浴,可将ELISA板置于水浴中,ELISA板底应贴着水面,以使温度迅速平衡。为了避免板内试剂的蒸发,孔板应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。若用保温箱,ELISA板应放在湿盒内,湿盒要选用传热性良好的材料如金属等,应在盒的底部垫上湿的纱布,最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒首先要放在保温箱中预温至规定的温度,特别是在气温较低的时候更应该如此。为了保证各板的温度都能迅速平衡,无论是水浴还是湿盒温育,反应板均不宜叠放。用室温温育时,只要将ELISA板平置于操作台上即可,且室温应严格限制在规定的范围内(20-25℃),但具体操作时还是要根据说明书的要求控制温育。

(4) 洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,却决定着实验的成败。ELSIA是靠洗涤来达到分离游离和结合酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中,洗涤是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。

洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外,手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种,过程如下:

① 浸泡式:

a.吸干或甩干孔内反应液;

b.先用洗涤液洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去);

c.浸泡,再将洗涤液注满板孔,放置1-2min ,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短;

d.吸干孔内液体。吸干应彻底,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;

e.重复操作c和d,洗涤3-4次(或按说明规定)。在间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多是含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%-0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

②流水冲洗式:

流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤,洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置,使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗,持续冲洗2min后,吸干液体,再用蒸馏水浸泡2min,吸干即可。浸泡式犹如盆浴,流水冲洗式则好比淋浴,其洗涤效果更为彻底,且也简便、快速。实验表明,流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压,让水流冲击板孔表面,洗涤效果更佳。

(5) 显色和比色

① 显色

显色是ELISA中的最后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长呈色也逐渐增强。适当提高温度有助于加速显色。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长。

OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30min后即不再加深,若再延长反应时间,只可以使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色,故显色反应应避光进行,显色反应结束时立即加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后,显色由橙黄色转向棕黄色。

TMB对光照的不敏感,可在室温中边反应边观察结果。但为保证实验结果的稳定性,宜在规定的时间内阅读结果。TMB经HRP作用后,约40min显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2h后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24h)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

② 比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验,需先将板置于标准96孔的座架中,才可进行比色。最好在加底物液显色前,先将软板边缘剪净,这样,此板就可完全平妥坐入座架中。

比色时应先以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。

比色结果的表达在以往通用光密度(OD),而目前则按规定使用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是,将吸收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。

③ 酶标比色仪

酶标比色仪简称酶标仪,通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%。举例说,若某孔测得的A值为1.083,则该孔相对于空气的真实A值应为1.083±0.01(1.073~1.093),重复测定数次,其A值均应1.083±0.05(1.078~1.088)在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000,新型号的酶标仪上限拓宽达2.900,甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同,线性范围常小于可测范围,比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900,而其线性范围仅0.000~2.000,这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。

酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15~30℃,使用前先预热仪器15~30min,测读结果更稳定。

测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读,即每孔先后测读两次,第一次在最适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1,630nm为W2,最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

 
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